【切細胞】
《Material》
- PBS
- Medium
- Trypsin
- Dish/Flask
《Steps》
- 從Incubator中取出正在養的細胞(注意別讓細胞的medium顏色太黃，代表太酸了)
- 在顯微鏡下觀察細胞生長情形
- Wash by PBS, twice. (10 cm dish: 7~10 mL, 6 cm dish: 3~5 mL, 75T falsk: 10~12 mL )
- Add 1000 μL Trypsin, wait for about 5 minutes. (依細胞狀況而定，切了之後溶液會成混濁狀)
- 加完後放入Ecubator, 同時準備要分裝的dish/flask
- 先加medium到dish/flask
- 取出cells cut by trypsin, 用顯微鏡稍微觀察一下，並且觀察溶液顏色
- 加入medium(沖淡trypsin，使其停止作用，但要注意別加太多)
- 吸、沖、吸、沖、吸、沖，約五次，沖洗dish/flask表面上的細胞，然後全部溶液要再updown混勻
- 分裝到剛剛準備的新dish/flask(看情形決定要一分二或一分三，頂多能分四分)
- 放入Incubator，讓細胞生長，OVER!!!
《備註》
養細胞的時候要隨時注意medium的顏色(代表pH值大小)，千萬別讓細胞處在太酸的環境(黃)
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【細胞計數】
《Material》
Trypan Blue
細胞計數器(附圖一&二)
Eppendorf * 2(如果在flow裡拿eppendorf, 記得要用已過火的鑷子拿取)
《Steps》
- 要取細胞之前，要完完全全使細胞混合，所以要像上面步驟9一樣吸沖再updown，使之充分混合
- 取20 μL的細胞液至新的eppendorf，然後再加入20 μL的Trypan Blue，充分混合
- 於血球計數器的每邊，各注入10 μL 的細胞混合溶液，並於
顯微鏡下約放大100 倍作觀察。 - 利用計數器計算位於細胞計數器左右兩邊最中間大格裡的細菌數
- 並以下面方程式求出細胞濃度，例如Mary學姊算出來是32*10^4, 代表3.2*10^5 cells/ml
- 要計算全部的細胞液裡的細胞"總數"的話就是(3.2*10^5 cells/ml *2/2)*剩下的細胞液ml數2ml=6.4*10^5。
第二種計算方法
- 兩邊各5 大格區域內之所有細胞數目，每格的適當數目為20 ~ 100 個細胞。)
- 細胞濃度（cells/mL）＝10 格之細胞總數目×103
細胞濃度乘以細胞液之體積，即總細胞數目。
《細胞計數的原理》
- 細胞數目的計算可用血球計數盤（hemacytometer）如圖3.1，
或是Coulter counter 粒子計數器自動計數。使用血球計數盤
計數細胞，可以配合使用手按計數器（counter）以協助細胞
計數。 - 血球計數盤一般有二個chambers，每個chamber中細刻9 個1
mm2大正方形，中間的大正方形再細刻25 個中正方形，每邊
各由三條細線組成。4 個角落之大正方形則再細刻各16 個中
正方形，深度均為0.1 mm。當chamber上方蓋上蓋玻片後，
每個大正方形之體積為1 mm2×0.1 mm＝1.0×10-4 mL。使用
時，計數每個大正方形內之細胞數目，乘以稀釋倍數，再乘
以104，即為每mL中之細胞數目。 - 有關於細胞落在大正方形四邊三條細線上的計數原則，為數
算落於上邊及左邊線上的細胞，不算落於下邊及右邊線上的
細胞。 - 一般細胞液應充分分散，並稀釋到每個計數的大正方形中約
分佈50 ~ 100 個細胞，使計數較準確。每個大正方形中之細
胞數目不得低於20 個，以達計數之準確性。數目若太高則不
易算精確。 - 為達細胞計數的精確性，可以多計數幾個大正方形內之細胞
數目後，求得平均值。
資料來源: 組織工程特論及實驗 黃玲惠教授講義 第12/16頁
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